L'analisi combinata del proteoma e del metaboloma fornisce informazioni dettagliate sui microRNA
Aug 02, 2023Parassiti e vettori volume 16, numero articolo: 271 (2023) Citare questo articolo
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I virus patogeni possono essere trasmessi dalle zanzare femmine Aedes a Egypti (Ae. a Egypti) durante l'acquisizione della farina di sangue dai vertebrati. Il silenziamento del microRNA specifico delle zanzare e dell'intestino medio (miRNA) 1174 (miR-1174) compromette l'assunzione di sangue e aumenta la mortalità. Determinare l’identità delle proteine e dei metaboliti che rispondono alla deplezione del miR-1174 aumenterà la nostra comprensione dei meccanismi molecolari di questo miRNA nel controllo dell’alimentazione del sangue e del metabolismo dei nutrienti delle zanzare.
Oligonucleotidi antisenso (antagomiri [Ant]) Ant-1174 e Ant-Ct sono stati iniettati nella femmina Ae. a Egypti a 12-20 ore dalla chiusura e l'esaurimento di miR-1174 è stato confermato mediante PCR quantitativa in tempo reale a trascrizione inversa (RT-qPCR). Le zanzare iniettate con Ant-1174 e quelle di controllo sono state raccolte prima del pasto di sangue a 72 ore dopo l'iniezione per l'analisi proteomica basata su tag di massa tandem e l'analisi metabolomica non target con cromatografia liquida e spettrometria di massa tandem per identificare proteine e metaboliti differenzialmente espressi, rispettivamente. L'interferenza dell'RNA (RNAi) mediante iniezione di RNA a doppio filamento (dsRNA) è stata applicata per studiare i ruoli biologici di questi geni espressi in modo differenziale. L'effetto RNAi è stato verificato mediante RT-qPCR e saggi western blotting. Il contenuto di trigliceridi e i livelli di ATP sono stati misurati utilizzando gli appositi kit di analisi, seguendo le istruzioni dei produttori. Le analisi statistiche sono state condotte con il software GraphPad7 utilizzando il test t di Student.
Dopo l'esaurimento del miR-1174 specifico delle zanzare e dell'intestino medio, sono state identificate un totale di 383 proteine differenzialmente espresse (DEP), tra cui 258 erano sovraregolate e 125 sottoregolate. L'analisi funzionale di questi DEP utilizzando l'arricchimento di Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ha suggerito che miR-1174 svolge importanti ruoli regolatori nel metabolismo degli aminoacidi, nel metabolismo dei nucleotidi, nel metabolismo degli acidi grassi e nelle vie del metabolismo degli zuccheri. Sono stati identificati un totale di 292 metaboliti differenziali, di cui 141 sovraregolati e 151 sottoregolati. L'analisi integrativa ha mostrato che le proteine differenziali e i metaboliti associati erano arricchiti principalmente in una varietà di vie metaboliche, tra cui la glicolisi, il ciclo del citrato, la fosforilazione ossidativa e il metabolismo degli aminoacidi. Nello specifico, il gene di una proteina sovraregolata nelle zanzare impoverite di miR-1174, la purina nucleoside fosforilasi (PNP; AAEL002269), era associato alle vie metaboliche di purina, pirimidina e niacina-nicotinamide. L'abbattimento del PNP ha inibito seriamente la digestione del sangue e lo sviluppo delle ovaie e ha aumentato la mortalità degli adulti. Meccanicamente, l’esaurimento del PNP ha portato ad una significativa downregulation del gene della vitellogenina (Vg); inoltre, sono stati influenzati alcuni geni importanti nelle vie di segnalazione dell’ecdisone e dei peptidi simili all’insulina correlati allo sviluppo delle ovaie.
Questo studio dimostra un accumulo differenziale di proteine e metaboliti negli Ae impoveriti di miR-1174. zanzare aegiziane mediante tecniche proteomiche e metabolomiche. I risultati forniscono prove funzionali del ruolo del gene PNP sovraregolato nelle attività fisiologiche dell’intestino. I nostri risultati evidenziano cambiamenti molecolari chiave negli Ae impoveriti di miR-1174. aegizi e quindi fornire una base e nuove intuizioni per una maggiore comprensione del meccanismo molecolare coinvolto in un miRNA specifico del lignaggio nei vettori di zanzara.
Le femmine delle specie di zanzare vettori prelevano il sangue dai vertebrati per ottenere gli amminoacidi e altri nutrienti necessari per lo sviluppo delle uova; di conseguenza, fungono da vettori di un gran numero di agenti patogeni virali. Con l’urbanizzazione globale e il continuo riscaldamento del clima, il rischio di malattie trasmesse dalle zanzare è in aumento in tutto il mondo, ponendo una seria sfida alla salute pubblica e imponendo oneri economici significativi a molti paesi [1]. Negli ultimi anni hanno guadagnato consenso una serie di strategie e tecnologie promettenti per il controllo dei vettori delle zanzare basate sulla manipolazione genetica [2,3,4,5]. Tuttavia, la mancanza di interventi medici efficaci limita ancora la prevenzione e il controllo della maggior parte delle malattie trasmesse dalle zanzare.
1.2, as described in other studies [13,14,15,16] (Additional file 3: Table S3). The DEPs were subjected to GO enrichment [17] and KEGG pathway enrichment analyses [18]./p> 1 and P < 0.05 (unpaired two-sided Student’s t-tests) in the OPLS-DA model were considered to be differentially expressed metabolites (DEMs). Volcano plots and a hierarchically clustered heatmap were plotted to visualize significant features of the identified DEMs. Commercial databases, including KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) and MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca/), were used for pathway enrichment analysis. Finally, integrated analysis of the proteome and metabolome was performed for the differential proteins and metabolites./p> 1.8 was considered to be satisfactory for subsequent experiments. The integrity of the extracted RNA was checked by 1% agarose gel electrophoresis. All primer pairs for the real time quantitative PCR (RT-qPCR) amplification of genes were designed using the software Primer Premier 5.0 and then synthesized at Sangon Biotech (Shanghai, China) (Additional file 7: Table S7). To examine the expression of the protein-coding genes, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into complementary DNA (cDNA) using the SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan). RT-qPCR was performed using TB Green Premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus; TaKaRa Bio Inc.). The reaction volume (20 µl) contained 10 µl of 2× NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (Tiangen Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl ROX Dye II, 2 µl diluted cDNA and 6.8 µl ddH2O. Ribosomal protein S7 (RPS7; AAEL009496-RA) served as the internal control. Reactions were conducted on an ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). The amplification procedure was: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 1 min and 60 °C for 1 min; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s. To examine the expression level of miR-1174, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into cDNA using the SynScript® III miRNA RT SuperMix (TSK3001; Tsingke Biotechnology Co.,Ltd., Beijing, China). RT-qPCR was performed using a miRNA Universal SYBR qPCR Mix (TSE2001; Tsingke Biotechnology Co., Ltd.). The total reaction volume (20 µl) contained 10 µl of miRNA Universal SYBR qPCR Mix (Tsingke Biotechnology Co., Ltd.), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl of 50× ROX Reference Dye II, 2 µl of diluted cDNA and 6.8 µl of ddH2O. Small nuclear RNA (snRNA) U6 (AAEL029000-RA) was used as the internal control. Reactions were conducted on the ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) using the following amplification procedure: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 10 s and 60 °C for 30 s; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s./p> 1.2, as used in other studies [13,14,15,16], we determined 383 DEPs, of which 258 were upregulated and 125 were downregulated (Fig. 1c; Additional file 8: Table S8). Hierarchical cluster analysis showed that these 383 DEPs were separated into upregulated and downregulated clades, and that the Ant-1174 group was differentiated from the control group (Fig. 1d); thus, miR-1174 depletion substantially caused a global protein expression response in mosquitoes./p> 1.2 or < 0.83, P < 0.05) illustrating the proteins differentially expressed between the Ant-1174 and control groups. The significantly upregulated differentially expressed proteins are shown in red, the significantly downregulated differentially expressed proteins are shown in blue and the proteins with no significant difference are shown in gray. d Hierarchical clustering analysis of the differentially expressed proteins visualized as a heatmap. The color blocks in different positions represent the relative expression of the corresponding proteins: red represents high expression and blue represents low expression. e Bubble chart showing GO enrichment of Ant-1174 vs Control. f KEGG pathways enriched by differentially expressed proteins between Ant-1174 and control group. Ant-1174/Ant-Ct, antisense oligonucleotides (antagomirs) Ant-1174/Ant-Ct; BP, biological Process; CC, cellular component; GO, Gene Ontology; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MF, molecular function; miRNA-1174, microRNA-1174; PIJ, postinjection; WT, wild type/p> 1 and P value (in a Student’s t-test) < 0.05 yielded 292 differential metabolites, of which 141 were upregulated and 151 were downregulated (Fig. 2d; Additional file 9: Table S9). Hierarchical clustering analysis of these differential metabolites showed that samples of the same group were clustered in one clade and those of different groups were separated from each other (Fig. 2e; Additional file 10: Table S10). The upregulated metabolites could be divided into 10 super classes, of which the top five were organic acids and their derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; organic oxygen compounds; and benzenoids (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). The downregulated metabolites could be divided into 11 super classes, of which the top five were organic oxygen compounds; organic acids and derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; and nucleosides, nucleotides and analogs (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). In the super class organic acids and derivatives, 41 metabolites (76%) of POS mode and 24 metabolites (69%) of NEG mode belonged to the subclass amino acids, peptides and analogs. In the super class organic oxygen compounds, eight metabolites (62%) of POS mode and 29 metabolites (81%) of NEG mode belonged to the subclass carbohydrates and carbohydrate conjugates. We then performed a KEGG pathway enrichment analysis of these DEMs (Fig. 2g; Additional file 12: Table S12), which revealed that the DEMs were mainly enriched in the pathway aminoacyl-tRNA biosynthesis, followed by purine metabolism, glycerophospholipid metabolism, galactose metabolism, pyrimidine metabolism, glycine, serine and threonine metabolism, arginine and proline metabolism, pentose and glucuronate interconversions, alanine, aspartate and glutamate metabolism, cysteine and methionine metabolism, lysine degradation, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, sphingolipid metabolism and glyoxylate and dicarboxylate metabolism./p>
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